卡梅德生物技术快报｜【生物实验技术】免疫共沉淀（Co-IP）完整流程｜拟南芥 DSP1 互作蛋白鉴定实战

本文为可复现版免疫共沉淀实验笔记以拟南芥 DSP1 蛋白互作鉴定为案例详细讲解 Co-IP 实验设计、操作步骤、关键质控点、数据处理方法适合生物信息、分子生物学实验室参考使用。一、研究目的利用免疫共沉淀Co-IP联合 LC-MS/MS 技术在拟南芥体内捕获与 DSP1 结合的蛋白复合物高通量鉴定潜在互作蛋白构建 DSP1 互作网络为后续功能机制研究提供靶点。二、核心材料与仪器实验材料拟南芥 Col-2 株系、pGEX-6p-1 原核表达载体、大肠杆菌 BL21 感受态试剂IPTG、GST 亲和层析柱、Protein G 磁珠、Anti-DSP1 多克隆抗体、蛋白酶抑制剂仪器低温离心机、超声破碎仪、Western Blot 系统、液相色谱串联质谱仪。三、免疫共沉淀Co-IP核心实验步骤1. 重组蛋白制备Co-IP 抗体抗原克隆 DSP1-N 片段构建 pGEX-6p-1-DSP1-N 重组质粒转化 BL21OD6000.6~1.0 时加 1mmol/L IPTG16℃诱导 20h超声破碎菌体GST 亲和层析纯化SDS-PAGE 与质谱鉴定蛋白正确性。2. 多克隆抗体制备与验证纯化 GST-DSP1-N 作为抗原制备多克隆抗体Western Blot 验证抗体可特异性识别内源 DSP1核蛋白样本条带更清晰。3. 拟南芥细胞核蛋白提取关键提高 Co-IP 靶标丰度DSP1 为核定位蛋白提取核蛋白可大幅降低背景干扰取拟南芥地上组织液氮研磨加入核蛋白提取液冰上裂解梯度离心纯化细胞核裂解获得核总蛋白。4. 免疫共沉淀实验标准操作流程磁珠预处理取 Dynabeads Protein G 磁珠PBS 洗涤 2 次抗体偶联磁珠与 Anti-DSP1 抗体室温旋转孵育 10min使抗体充分结合磁珠封闭非特异性位点用 1% BSA 封闭减少非特异性结合抗原结合磁珠 - 抗体复合物与核蛋白 4℃旋转孵育 2h严格洗涤含 0.01% Tween 20 的 PBS 洗涤 5 次去除未结合蛋白蛋白洗脱低温洗脱获得 Co-IP 富集的蛋白复合物。5. 阴性对照设置使用无关 Anti-MYC 抗体替代 DSP1 抗体其余步骤完全一致用于剔除非特异性结合蛋白。6. 质谱鉴定与数据分析将 Co-IP 产物酶解后进行 LC-MS/MS 检测比对拟南芥数据库过滤参数unique peptide≥1、蛋白匹配度分数 1.9扣除阴性对照背景得到高可信度互作蛋白列表。四、实验结果重组蛋白GST-DSP1-N 表达纯化成功质谱匹配度 92.96%抗体验证特异性良好可识别内源 DSP1Co-IP 质谱共鉴定 45 个潜在 DSP1 互作蛋白功能富集于蛋白代谢、核酸结合实验质控阴性对照无明显非特异条带Co-IP 特异性达标。五、Co-IP 实验关键质控点避坑指南蛋白样本核定位蛋白必须提取核蛋白提升目标丰度抗体质量特异性是 Co-IP 成败核心必须提前做 WB 验证孵育条件4℃低温孵育防止蛋白降解维持相互作用洗涤强度过低背景高过高破坏弱互作需梯度优化对照设置必须设置阴性对照排除抗体、磁珠非特异结合。六、技术总结免疫共沉淀是体内蛋白互作研究的标准技术尤其适合难以体外表达的蛋白。本研究建立的 “DSP1-N 表达→抗体制备→核蛋白 Co-IP→质谱鉴定” 流程稳定可靠可直接复用于植物核蛋白、复合物亚基、转录因子互作筛选。Co-IP 联合质谱不仅能快速获得互作蛋白列表还能为后续分子机制、信号通路研究提供坚实数据支撑。参考文献沈敏徐道博彭美玲等。通过免疫共沉淀和蛋白质谱鉴定与拟南芥 DSP1 互作的蛋白 [J]. 基因组学与应用生物学2024,43 (3):387-399.