单细胞蛋白组Abseq联合流式技术，深度解锁肿瘤与感染免疫差异奥秘

在科研领域单细胞蛋白组技术凭借其精准解析单个细胞蛋白表达特征的优势成为探究免疫机制、挖掘疾病生物标志物的核心工具。其中Abseq单细胞蛋白组技术表现突出能够实现对单细胞水平蛋白表达的高效、精准检测为复杂疾病的机制研究提供关键支撑。在Nature的一项重要研究中科研人员充分发挥Abseq单细胞蛋白组技术的独特优势结合流式分析技术取得了突破性发现——成功鉴定出肿瘤特异的Treg细胞并确定了其生物标志物这一成果为未来肿瘤靶向治疗带来了新的曙光。值得一提的是在这项研究中Abseq单细胞蛋白组技术与流式分析技术发挥了关键作用二者配合默契、相得益彰。大量实验结果显示两种技术相互验证为研究结果提供了坚实的支撑。其中还在单细胞RNA测序样本处理环节全部采用流式分选技术进行样本富集这一操作不仅显著提升了单细胞数据分析的精度还有效节约了测序成本。而Abseq单细胞蛋白组技术与流式技术强强联合为单细胞研究打造了一套全方位、多维度的解决方案诚邀广大科研、临床及工业领域的用户踊跃试用接下来详细介绍这篇发表在Nature期刊上的文章——“Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation”。该研究对头颈部鳞状细胞癌HNSCC以及部位匹配的非恶性炎症口腔粘膜OM的免疫特征展开了系统性分析。研究过程中科研人员发现了一群独特的肿瘤特异Treg亚群。这群细胞具有显著的免疫抑制特性能够对TCR信号做出应答并且处于活跃增殖状态。更为重要的是研究团队借助Abseq技术创新性地鉴定出了该亚群的生物标志物这一发现为肿瘤精准治疗开辟了全新的思路。研究背景免疫疗法在癌症治疗领域已取得了令人瞩目的成功然而其发展之路并非一帆风顺仍面临着诸多挑战。其中一个亟待解决的问题是免疫疗法所靶向的通路并非肿瘤专属在其他组织微环境中同样存在。尽管目前已有大量研究聚焦于肿瘤微环境的炎症反应但我们对肿瘤特异的免疫变化依然知之甚少这在一定程度上限制了免疫疗法在肿瘤治疗中的精准应用和进一步发展。研究方法1单细胞蛋白组与RNA测序联合技术2流式分析技术实验结果1. OM和HNSCC的免疫表型趋于一致在肿瘤组织中功能衰竭的T细胞和Treg细胞往往被视为抗肿瘤免疫反应失效的关键因素且T细胞的效应功能与抗原呈递细胞APCsAntigen Presenting Cells紧密相关。为深入探究相关免疫机制作者运用两组包含30个参数的高维流式panel对OM和HNSCC组织及血液中的免疫细胞图谱进行了深度剖析。研究结果令人意外OM和HNSCC组织的免疫表型竟基本相似。在CD45活细胞中CD3 T细胞、CD19 B细胞以及CD56 NK细胞的比例还有CD4/CD8比例都大致相同Fig 1a。在APC细胞方面cDC2s、DC3及CD16非常规单核细胞的比例在OM和HNSCC组织中也基本一致不过CD141 cDC1s在HNSCC肿瘤组织中的比例略低Fig 1b。为了精准鉴定特定免疫亚群之间的差异作者借助了FAUST这一机器算法。该算法能够以无监督的方式发现并注释统计上相关的细胞表型。结果显示在T细胞panel中HNSCC组织中富集了一个CD8 T细胞亚群和四个CD4 Treg亚群在APC细胞panel中HNSCC组织中富集了CD40及PD-L1共表达的CD14细胞以及cDC2s、DC3细胞。2. 分析肿瘤富集的APC与T细胞之间的细胞通讯为进一步探究上述免疫细胞的一致性与区别作者采用了单细胞RNA测序技术不仅发现了与流式结果相一致的免疫表型还鉴定出了肿瘤特有的转录特征和蛋白表达特征。随后作者运用NicheNet方法对肿瘤特异性的T细胞和APC细胞通讯展开了研究。研究发现HNSCC肿瘤T-APC细胞通讯中富集的配体受体相互作用情况如下ICOS配体通过ICOS发挥作用IL-18通过IL18-R1发挥作用IL1B通过IL-1受体1型及2型发挥作用。鉴于流式和单细胞RNA测序scRNA-seq均显示HNSCC肿瘤Tregs细胞存在差异作者进一步对Treg-APC的相互作用进行了验证。通过流式分析发现IL1R1在T细胞与APC通讯中富集特异性地表达在肿瘤浸润的Treg细胞上Figure 2a。几乎所有的IL1R1 T细胞都共表达ICOS、IL-18R1以及趋化因子受体CXCR6Figure 2b。3. IL1R1 Treg细胞的单细胞转录组与蛋白组特征分析为了更清晰地区分肿瘤浸润的IL1R1 Treg细胞和IL1R1- Treg细胞作者从OM、HNSCC以及外周血中分选了Treg细胞并结合免疫响应基因panel进行单细胞RNA测序。结果显示肿瘤中的IL1R1 Treg细胞Figure 3a橙色亚群和IL1R1- Treg细胞Figure 3a蓝色亚群各自形成了独立的亚群与外周血Treg细胞存在明显差异。在IL1R1 Treg细胞中选择性富集了超过50个转录本Figure 3b其中包括TNFRSF18编码GITR和TNFRSF9编码4-1BB这类细胞在蛋白水平也呈现出特异性表达特征表明IL1R1 Treg细胞代表了肿瘤浸润Treg细胞中一群具有独特转录组特征的免疫亚群。4. IL1R1 Treg细胞高度抑制性的功能研究在CD8 T细胞及CD4 T细胞的体外增殖抑制实验中IL1R1 Treg细胞展现出了比IL1R1- Treg细胞更有效的抑制效果Figure 4a。另外通过anti-CD3、anti-CD28和anti-CD2磁珠刺激肿瘤浸润IL1R1 Treg细胞中IL1R1的表达在第1天升高第2-3天下降Figure 4b。这一现象提示IL1R1 Treg细胞能够应答TCR信号并调控IL1R1的表达。为进一步研究肿瘤浸润IL1R1 Treg细胞应答激活信号的免疫反应作者利用佛波酯PMA及离子霉素进行短时间刺激然后运用单细胞转录组联合Abseq膜蛋白测序技术系统分析了这类细胞的转录组和蛋白组变化。对CD4 T细胞及Treg细胞进行无监督聚类分析后结果显示存在三个Treg亚群IL1R1-、IL1R1及活跃增殖的IL1R1 Treg细胞。PMA及离子霉素刺激后Treg细胞的差异表达蛋白及差异表达基因情况如图Figure 5a-b所示。例如这类细胞高表达TNFRSF9及CTLA4转录本并且通过Abseq技术检测证实其CTLA4蛋白显著高表达。这表明IL1R1 Treg细胞处于激活状态且具有功能活性并且存在一个活跃增殖的亚群。通过Abseq单细胞膜蛋白检测结果作者成功鉴定出一组生物标记物能够唯一地识别IL1R1 Treg细胞。仅使用2个膜表面蛋白就可以从组织和外周血所有CD45的免疫细胞中标记出这类细胞。并且通过流式分析验证了标志物的特异性几乎所有的CD45IL1R1ICOS细胞都是Treg细胞Figure 6a。这一发现依托Abseq技术的精准蛋白检测能力为未来靶向肿瘤特异性Treg细胞的治疗提供了全新的思路和靶点。最后作者通过实验验证并结合公开的scRNA-seq数据集涵盖19种不同的肿瘤类型分析发现IL1R1 Treg细胞并非仅特异性存在于HNSCC肿瘤中而是以不同比例分布于各种实体肿瘤中。清除肿瘤浸润性Treg细胞被认为是一种极具前景的抗肿瘤治疗方法而该研究借助Abseq技术鉴定出的肿瘤特异Treg细胞生物标志物为靶向肿瘤特异Treg细胞、同时不影响其他Treg细胞的免疫调节功能提供了可能为肿瘤免疫治疗的精准化发展奠定了基础。