AbMole丨骨代谢调控解析：破骨细胞、成骨细胞研究中的常用试剂

骨骼是机体重要的支撑组织骨骼的稳态维持依赖于成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡这一过程也被称为骨重塑。破骨细胞起源于造血单核巨噬细胞谱系是唯一具有骨吸收功能的细胞能分泌盐酸酸化环境并释放蛋白酶降解骨基质成分实现骨吸收功能。成骨细胞起源于间充质干细胞主要功能为合成并分泌骨基质包括胶原蛋白、骨钙素等促进骨基质矿化完成骨形成过程。当骨吸收速率超过骨形成速率时骨量减少、骨微结构破坏最终引发骨质疏松。在破骨细胞、骨吸收及骨质疏松的基础研究中各类试剂发挥着关键作用。图 1. The role of estrogen deficiency in the pathogenesis of osteoporosis[1].一、双膦酸盐类试剂Zoledronic AcidZoledronate唑来膦酸AbMoleM2329具有较强的长效抗骨吸收作用。Zoledronic AcidZoledronate可以抑制法尼基焦磷酸合酶farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS该酶是甲羟戊酸途径中的关键调控酶。Zoledronic AcidZOL 446通过抑制FPPS的活性降低了香叶基香叶基焦磷酸GGPP的水平上述变化将导致小GTP酶包括Rab, Rho, Rac的异戊烯化障碍并诱导细胞骨架解体和破骨细胞的凋亡。除经典的甲羟戊酸途径抑制外Zoledronic AcidCAS No.118072-93-8还能通过直接调控RANKL 诱导的信号转导通路影响破骨细胞分化。Zoledronate唑来膦酸0.1-5 µM在RAW264.7细胞模型中以剂量依赖性方式抑制RANKL 诱导的IκBα磷酸化和降解阻断p65亚基的核转位从而抑制NF-κB靶基因的转录激活[2]。此外还有文献表明Zoledronic AcidCGP42446能通过p53通路促进破骨细胞的铁死亡这是一种铁依赖性的脂质过氧化性细胞死亡方式[3]。并且Zoledronic acidCAS No.118072-93-8还是一种动物骨质疏松症和骨坏死模型的常用造模剂。Alendronic acid阿仑膦酸BisphosphonateAbMoleM45244与AlendronateAlendronate sodium hydrate阿仑膦酸钠AbMoleM3272为同一种试剂的不同存在形式前者为游离酸后者为钠盐形式。Alendronic acid是一种含氮双膦酸盐N-BP其核心分子靶点同样为法尼基焦磷酸合酶farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS。Alendronic acidCAS No.66376-36-1能有效诱导破骨细胞的凋亡进而导致骨吸收抑制。阿仑膦酸在J774巨噬细胞模型中处理约16小时后出现凋亡细胞并伴随染色质凝缩、DNA片段化和caspase-3样活性升高[4]。Ibandronate伊班膦酸钠BM-210955AbMoleM2763作为第二代含氮双膦酸盐在骨细胞相关研究中展现出独特的应用价值。其分子结构特征为P-C-P骨架碳原子上连接了一个含氮侧链这一结构使IbandronateCAS No.138926-19-9成为具有中高效力的法尼基焦磷酸合酶抑制剂并阻断甲羟戊酸的合成进而影响小GTP酶的异戊烯化修饰最终造成破骨细胞的骨架解体、皱褶缘功能障碍和囊泡运输中断诱导细胞凋亡并阻断前体细胞向成熟破骨细胞的分化过程。PamidronateCGP 23339A帕米膦酸AbMoleM2250是第二代含氮双膦酸盐aminobisphosphonate其分子结构特征为P-C-P骨架的碳原子上连接一个氨基侧链。作为第二代含氮双膦酸盐的代表Pamidronate的抗骨吸收效力比第一代高约100倍。Pamidronate CAS No.57248-88-1能高效抑制法尼基焦磷酸合酶farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS并发挥抗骨吸收的功效。Pamidronate帕米膦酸具有较长的骨骼半衰期在大鼠模型中估计为90140天[5]。这种长期滞留特性使其在骨组织中积累高浓度帕米膦酸能削弱骨强度并延迟骨折愈合。此外Pamidronate10 mg/kg/周能使卵巢切除小鼠骨密度增加超过假手术组2倍[6]。Risedronic acidRisedronate利塞膦酸AbMoleM5934是第三代含氮杂环双膦酸盐heterocyclic nitrogen-containing bisphosphonate其分子结构特征为P-C-P骨架的碳原子上连接了一个吡啶基pyridinyl侧链。Risedronate通过强效抑制FPPS阻断甲羟戊酸途径这是其抗骨吸收作用的核心分子机制。Risedronic acid不仅诱导成熟破骨细胞的凋亡还能阻断破骨细胞前体向成熟细胞的分化。Risedronic acid CAS No.115436-72-1在骨组织中具有更广泛的分布不仅局限于骨小梁表面还能到达皮质骨和骨细胞网络osteocyte lacunar-canalicular system。此外研究表明Risedronate具有促成骨分化作用。Risedronate在骨髓基质细胞BMSCs中可增强细胞增殖启动成骨细胞分化上调碱性磷酸酶ALP活性、I型胶原和骨钙素表达[7]。Clodronic acidM59183氯屈膦酸AbMoleM59183是第一代非含氮双膦酸盐其分子结构中的P-C-P骨架的碳原子上连接了两个氯原子Cl₂C-P而非含氮双膦酸盐中的氮原子。与含氮双膦酸盐通过抑制法尼基焦磷酸合酶FPPS阻断甲羟戊酸途径不同Clodronic acidClodronate的作用不依赖于FPPS的抑制。Clodronic acidClodronate在被破骨细胞或巨噬细胞摄取后能在细胞内代谢生成β,γ-二氯亚甲基ATPAppCCl₂p这是一种非水解性ATP类似物该代谢物在细胞内积累竞争性抑制ATP依赖性酶如腺苷酸激酶和ATP合酶干扰能量代谢最终诱导破骨细胞和巨噬细胞凋亡。Clodronic acidCAS No.10596-23-3还能抑制成骨细胞分泌RANKL间接减少了破骨细胞分化。Tiludronate替鲁膦酸的作用机理与Clodronic acid类似Tiludronate能优先作用于已形成皱褶缘的极化破骨细胞但对破骨细胞前体的迁移、融合过程无显著影响。Tiludronate还能抑制破骨细胞V-ATPases液泡型H⁺-ATP酶阻止质子分泌至骨吸收陷窝以及促进成熟破骨细胞脱离骨基质detachment。Tiludronate还具有抗炎特性Tiludronate在脂多糖LPS激活的巨噬细胞中能剂量依赖性抑制促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和一氧化氮NO的分泌。Tiludronate在破骨细胞骨吸收抑制实验中的常用浓度为0.1 - 100 µM[8]。二、破骨细胞与成骨细胞分化调控试剂骨重塑平衡的维持依赖于破骨细胞与成骨细胞的协同调控破骨细胞的分化成熟依赖于RANKL、M-CSF 及NFATc1等信号分子的调控。小分子调节剂通过靶向上述破骨细胞、成骨细胞分化相关的信号通路调节两种细胞的功能为骨质疏松的机制研究提供重要工具。β-甘油磷酸β-Glycerophosphate, β-GPAbMoleM3837是一种常用的有机磷酸盐供体在体外骨生物学研究中广泛用于模拟生理性矿化微环境促进间充质干细胞MSCs及成骨前体细胞向成骨细胞定向分化并诱导细胞外基质钙盐沉积。在细胞实验中β-GlycerophosphateCAS No.13408-09-8常与抗坏血酸Vitamin C、Dexamethasone地塞米松联合构成经典的成骨诱导体系β-Glycerophosphate通过提供无机磷酸根促进成体前体细胞的碱性磷酸酶ALP的活性升高、成骨标志物如Runx2、骨钙素、I型胶原表达上调及钙结节形成。值得注意的是β-Glycerophosphate能与BMP-2 等因子产生协同作用在特定浓度下增强成骨分化效应。XAV-939AbMoleM1796是一种端锚酶Tankyrase抑制剂能通过抑制端锚酶活性负调控Wnt信号通路同时能显著促进人骨髓间充质干细胞hMSCs向成骨细胞的分化增加碱性磷酸酶活性与矿化基质形成上调成骨相关基因的表达。此外XAV-939CAS No.284028-89-3还可调节成骨细胞中RANKL与OPG的表达间接抑制破骨细胞的活性实现破骨细胞与成骨细胞的协同调控常用于骨代谢调控机制的基础研究为骨质疏松的多靶点干预提供了工具。OmaveloxoloneRTA-408AbMoleM10081是一种三萜类化合物属于抗氧化炎症调节剂在骨细胞相关研究中展现出独特的应用价值。Omaveloxolone奥马索龙能通过激活Nrf2抑制破骨细胞的过度活化。在破骨细胞分化过程中RANKL诱导的活性氧ROS产生是关键的第二信使ROS可激活NF-κB和NFATc1并增强RANKL信号传导促进破骨细胞生成和骨吸收功能。由OmaveloxoloneCAS No.1474034-05-3激活的Nrf2能通过介导抗氧化和抗炎作用从而抑制上述破骨细胞的生成一方面增加下游抗氧化酶的表达维持细胞氧化还原稳态抑制活性氧另一方面限制NF-κB激活并减少促炎细胞因子的表达间接削弱RANKL信号和炎症驱动的破骨细胞生成。还有研究表明Omaveloxolone在RANKL诱导的破骨细胞生成实验中能通过抑制STING依赖的NF-κB信号通路有效阻断破骨细胞分化。Corylin补骨脂异黄酮AbMoleM13462是一种从传统抗骨质疏松植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的种子中提取的天然异戊烯基黄酮类化合物。在骨细胞相关研究中展现出多靶点调控活性。在成骨细胞方面体外实验证实Corylin可促进成骨细胞及间充质祖细胞来源的骨微团的分化与矿化显著上调Runx2、Osterix、Col1和ALP等成骨标志物表达其机制涉及激活Wnt/β-catenin信号通路促进β-catenin核转位及雌激素受体依赖性的通路。在破骨调控方面CorylinCAS No.53947-92-5能抑制RANKL诱导的小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞的分化下调NFATc1、c-fos等转录因子表达抑制NF-κB核易位、F-肌动蛋白环形成及破骨细胞的迁移同时减弱破骨细胞线粒体的功能[9]。BavachalconeBroussochalcone B补骨脂查耳酮AbMoleM13460是补骨脂和决明子中的查尔酮类成分在骨代谢相关基础研究中展现出对破骨与成骨过程的双向调控潜力。浓度为8μM的Bavachalcone补骨脂查耳酮能抑制RANKL诱导的骨髓单核/巨噬细胞BMMs向破骨细胞的分化及骨吸收功能且未观察到细胞毒性其机制涉及抑制IκBα降解与NF-κB磷酸化以及下调破骨细胞特异性基因如TRAP、组织蛋白酶K、MMP9及相关蛋白的表达并通过降低miR-193-3p的水平干预分化过程[10]。BavachalconeCAS28448-85-3在RAW264.7细胞模型中能高亲和力结合雌激素受体αERα抑制ERK与NF-κB信号通路活化降低NFATc1和c-Fos转录因子表达该作用可被ERα拮抗剂AZD9496 逆转在去卵巢诱导的骨质疏松小鼠模型中Bavachalcone的干预可显著减轻小鼠骨量的丢失并减少骨髓与脾脏中巨噬细胞的M1型极化[11]。Bropirimine(U-54461AbMoleM8260)是一种具有良好口服生物活性的 Toll 样受体7TLR7特异性激动剂其独特的分子结构使其能够通过口服给药的形式被小鼠有效吸收进而发挥调控免疫功能与骨代谢的双重作用。在骨代谢调控研究中体外实验证实Bropirimine能显著抑制RANKL 诱导的小鼠BMMs细胞骨髓衍生巨噬细胞向破骨细胞谱系的分化过程。Muramyl dipeptideMDPMuramyl Dipeptide佐剂肽AbMoleM7008是细菌肽聚糖中的一个片段。Muramyl dipeptide本身作为胞内模式识别受体NOD2的配体可激活先天免疫信号通路因此常作为佐剂使用但同时也在骨代谢调控中展现出重要作用。例如Muramyl dipeptideCAS No.53678-77-6被证实可通过NOD2受体依赖机制促进成骨细胞分化与骨形成在小鼠模型中经腹腔注射或口服给予Muramyl dipeptide可显著提升骨密度与骨体积增强血清骨形成标志物P1NP的水平并通过激活Runx2转录因子及经典Wnt/β-catenin信号通路促进成骨活性同时Muramyl dipeptide处理小鼠后可下调RANKL/OPG比值这间接抑制了破骨细胞的生成。Muramyl dipeptide在由RANKL 诱导或卵巢去除诱导的骨质疏松小鼠模型中能有效缓解骨量丢失[12]。Asperosaponin VIASA VI川续断皂苷VIAbMoleM4705是续断一种植物中的皂苷成分能调节骨代谢和骨平衡中的多个靶点。在细胞水平Asperosaponin VICAS No.39524-08-8能诱导间充质干细胞的成骨分化其机制与雌激素信号通路密切相关分子对接证实了Asperosaponin VI对雌激素受体2具有高亲和力[13]。Asperosaponin VI在大鼠脂肪来源的干细胞ADSCs中能显著增强碱性磷酸酶ALP活性与钙沉积上调骨钙素OCN、RUNX2表达及Smad2/3的磷酸化水平同时抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的释放促进成骨分化进程。Asperosaponin VI川续断皂苷VIAbMoleM4705还在去卵巢大鼠的骨髓基质细胞OVX rBMSCs中通过激活PI3K/AKT信号通路提升ALP活性、钙结节形成及成骨基因的表达该效应可被LY294002逆转[14]。Teriparatide特立帕肽AbMoleM14784是一种PTH1 受体的激动剂。Teriparatide在细胞中能激活PTH1R受体促进成骨细胞前体的增殖并抑制凋亡推动早期成骨细胞向成熟成骨细胞分化同时抑制其向脂肪细胞的分化。TeriparatideCAS No.52232-67-4还能在骨髓间充质干细胞hMSCs中通过调控circFNDC3B-miR-125a-5p-GLS等非编码RNA网络下调circFNDC3B与miR-125a-5p增强细胞谷氨酰胺代谢进而提升ALP活性、RUNX2、骨钙素、骨连接蛋白表达及钙沉积。此外TeriparatidehPTH (1-34)还能改善小鼠骨质疏松模型中的骨小梁微结构、骨体积分数及皮质骨陷窝形态[15]。Abaloparatide阿巴洛肽AbMoleM14799也是一种PTH1受体的激动剂。体外实验证实该肽可促进成骨细胞的增殖与分化上调Runx2、Col1A1、Alpl、Ocn等成骨标志基因。例如浓度为1 nM的AbaloparatideBIM 44058处理小鼠颅骨成骨细胞4小时即可调控179个基因表达其中大部分都与成骨分化有关并受到盐诱导激酶SIKs与CRTCs通路的调节。Abaloparatide在去卵巢大鼠模型中常用的浓度是25-50 μg/kg/d皮下注射持续6–12个月。结果显示Abaloparatide能显著提升骨小梁体积分数腰椎提高57%–78%股骨远端达145%–270%、皮质骨厚度及骨强度且不增加破骨细胞数量或骨吸收标志物[16]。此外Abaloparatide在小鼠脊柱融合模型中20 μg/kg/d连续给药28天可提升骨钙素水平、骨小梁数量及融合区微结构[17]。Menaquinone-7Vitamin MK-7Vitamin K2-7AbMoleM55300是维生素K中生物活性较强的形式在骨细胞相关研究中展现出多维度调控骨代谢的潜力。体外实验表明MK-7在MC3T3-E1成骨细胞系中以剂量依赖方式显著促进细胞增殖增强碱性磷酸酶活性和钙沉积其促钙沉积作用强于维生素K1且部分效应不受华法林γ-羧化抑制剂抑制同时MK-7还能显著上调骨保护素OPG与RANKL 的mRNA表达比值达329%说明其通过调节OPG/RANKL信号轴抑制破骨细胞形成。Menaquinone-7在诱导多能干细胞来源的间充质干细胞向成骨细胞分化过程中能提升RUNX2的表达、降低活性氧水平、增强细胞迁移能力并在后期促进碱性磷酸酶活性与胶原沉积推动细胞向成熟成骨表型转化[18]。此外在动物模型中钙限制的生长期Sprague-Dawley大鼠补充Menaquinone-7后股骨皮质厚度、皮质骨面积及骨钙含量显著增加骨微结构改善[19]。Alfacalcidol阿法骨化醇1-hydroxycholecalciferolAbMoleM5394作为一种维生素D3的类似物常用于成骨细胞功能的研究常见浓度为10–100 nM在此浓度下可促进成骨细胞分化、矿化及功能活性并通过维生素D受体VDR介导的信号通路调节骨代谢相关基因表达。动物实验方面AlfacalcidolCAS No.41294-56-8在去卵巢大鼠骨质疏松模型中以0.05 μg/鼠/d的给药剂量可显著提升骨密度同时下调血清骨代谢标志物BALP、TRAP-5b、BGP水平并抑制TGF-β1/Smad-2/3信号通路的蛋白与mRNA表达表明其对骨细胞信号转导具有调控作用。机制层面Alfacalcidol被证实可通过局部激活VDR调节骨形成与骨吸收平衡并影响TGF-β1/Smad等关键骨代谢通路。Strontium RanelateDistrontium renelate雷尼酸锶AbMoleM3954 是一种具有双重骨代谢调节活性的锶盐化合物。体外研究表明Strontium Ranelate能显著促进成骨细胞如MC3T3-E1细胞的增殖和矿化结的形成以及骨钙素等成骨相关蛋白的表达。同时Strontium Ranelate雷尼酸锶还能抑制破骨细胞分化与活性表现为降低抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP阳性细胞数量并调节OPG/RANKL信号轴下调RANKL表达、上调OPG水平。Strontium Ranelate( CAS No.135459-87-9)能用于骨质疏松症的动物模型大鼠、小鼠模型的研究。DIPQUOAbMoleM14488是一种碱性磷酸酶ALP激活剂在骨生物学基础研究中展现出促进成骨分化的作用。DIPQUO处理人骨髓间充质干细胞后可显著上调成骨关键转录因子Runx2、Osterix及晚期标志物Osteocalcin的表达并增强钙盐基质沉积。在动物模型方面DIPQUOCAS No.1269365-82-3在斑马鱼发育模型中能有效刺激椎体原基的骨化过程并在成年斑马鱼尾鳍再生过程中显著促进骨组织再生与成骨分化[20]。NFATc1-IN-1Compound A04是一种高度特异性的NFATc1抑制剂NFATc1-IN-1能通过阻断RANKL诱导的NFATc1核转位来抑制破骨细胞形成其半数抑制浓度为1.57μM表明其对破骨细胞生成具有高效的抑制活性。NFATc1是破骨细胞分化的主调控转录因子当RANKL与RANK结合后通过TRAF6激活下游信号级联包括NF-κB、MAPK和钙调神经磷酸酶通路最终导致NFATc1去磷酸化并发生核转位入核后的NFATc1与c-Fos/c-Jun形成复合物驱动破骨细胞特异性基因包括TRAP、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9和整合素β3的表达促进破骨细胞分化和骨吸收功能。三、选择性雌激素受体调节剂SERMs能通过选择性结合雌激素受体在不同组织中发挥激动或拮抗作用。SERMSs在骨骼研究中可模拟雌激素的作用调控破骨细胞与成骨细胞的功能。RaloxifeneKeoxifene雷洛昔芬AbMoleM20941LasofoxifeneCP-336156拉索昔芬AbMoleM28908和BazedoxifeneTSE-424巴多昔芬AbMoleM22417是骨骼研究中最常用的SERMs特别是在卵巢切除的小鼠模型中具有重要的应用。例如在去卵巢小鼠模型中系统性给予Raloxifene通过微型渗透泵可抑制脂多糖LPS诱导的牙槽骨骨密度下降。RaloxifeneCAS No.84449-90-1在骨质疏松大鼠模型中处理后能显著提升种大鼠的骨骼矿化沉积率及局部骨体积并上调成骨相关基因与蛋白的表达如Runx2、OCN。也有研究指出Raloxifene 能缓解肿瘤坏死因子-αTNF-α对骨髓间充质干细胞BMSCs成骨分化的抑制作用。Raloxifene在椎间盘退变小鼠模型中作为雌激素受体激动剂能有效调节椎间盘结构、力学性能及疼痛相关物质PSP在椎间盘细胞与骨细胞中的表达[21]。Lasofoxifene拉索昔芬AbMoleM28908和Bazedoxifene巴多昔芬AbMoleM22417也在骨研究中表现出调控能力。例如Lasofoxifene在乳腺癌骨转移的相关研究中能减少骨转移灶的形成并在体外有效抑制了ERα突变型乳腺癌细胞增殖[22]。Bazedoxifene在类风湿关节炎加糖皮质激素诱导的骨丢失的大鼠模型中以20 mg/kg/天的剂量和频次有效维持了骨密度[23]。四、成骨细胞检测试剂Alizarin Red SARS茜素红SAbMoleM1620是一种常用的骨矿化检测试剂可与成骨细胞分泌的骨基质中的钙结合形成红色复合物因此能在染色后用于分析成骨细胞的矿化结节形成情况可直观反映成骨细胞的矿化功能同时可辅助评估破骨细胞对骨基质的降解作用是骨代谢细胞实验中不可或缺的检测试剂。Alizarin Red SCAS No.130-22-3还能对小鼠体内的骨骼组织进行染色检测。Alizarin Red S的激发和发射波长分别为500 nm和570 nm。范例详解Nat Commun. 2023 Mar 14;14(1):1413.上述文章首次阐明了BRD9含溴结构域蛋白 9作为非经典的BAF染色质重塑复合物的关键亚基在破骨细胞生成中发挥着负反馈刹车作用完整揭示了BRD9-FOXP1-STAT1-IFNβ信号轴调控骨稳态的分子机制。在实验中科研人员使用了AbMole的JQ1AbMoleM2167和Zoledronic acidZometa唑来膦酸AbMoleM2329https://www.abmole.cn/products/zoledronic-acid.html其中JQ1作为BRD4抑制剂用于功能特异性对比研究分析证实BRD9的功能特异性和独特性。Zoledronic acid则作为一种强效抗骨吸收化合物与地塞米松 (Dexamethasone) 联合使用在小鼠中诱导颌骨坏死最终成功构建颌骨坏死ONJ模型用于开展动物体内的研究。图 2. BRD9 deletion/degrader mitigates LPS-induced bone resorption[24]参考文献及鸣谢[1] Zhivodernikov, I. V.; Kirichenko, T. V.; Markina, Y. V.; et al. Molecular and Cellular Mechanisms of Osteoporosis. International journal of molecular sciences2023, 24 (21).[2] Huang, X. L.; Liu, C.; Shi, X. M.; et al. Zoledronic acid inhibits osteoclastogenesis and bone resorptive function by suppressing RANKL‑mediated NF‑κB and JNK and their downstream signalling pathways. Molecular medicine reports2022, 25 (2).[3] Wang, B.; Zhan, Y.; Yan, L.; et al. How zoledronic acid improves osteoporosis by acting on osteoclasts. Frontiers in pharmacology2022, 13, 961941.[4] Cicco, S. R.; Vona, D.; Leone, G.; et al. In vivo functionalization of diatom biosilica with sodium alendronate as osteoactive material. Materials science engineering. C, Materials for biological applications2019, 104, 109897.[5] Yang, K. H.; Won, J. H.; Yoon, H. K.; et al. 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